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Cellular hypoxia is a common feature of solid tumors. Its contribution to the failure of radiotherapy and conventional chemotherapy makes it an ideal therapeutic target in oncology. During the recent years, targeting tumor hypoxia has led to the exploration of various therapeutics strategies, including the development of bioreductive (pro)drug: inactive molecules whose activation in hypoxemic environment gives extremely reactive metabolites which highly damage the DNA of hypoxia tumor cells. In combination with conventional therapies, such bioreductive (pro)drugs (Nitroimidazoles, metal complexes, quinones and N-oxides) could ensure, uniform destruction of the tumor mass, reducing relapses, metastases and systemic toxicity. Many clinical studies are striving to assess the potential value of these molecules (Tirapazamine, AQ4N, PR-104, TH-304) could make to existing therapeutic practice L’hypoxie cellulaire est une caractéristique commune aux tumeurs solides. Son incrimination dans l’échec de la radiothérapie et de la chimiothérapie conventionnelle en fait une cible thérapeutique idéale en cancérologie. Ces dernières années le ciblage de l’hypoxie tumorale a conduit à l’exploration de nombreuses stratégies thérapeutiques parmi lesquelles la synthèse des « bioreductive (pro) drugs », molécules inactives, dont la bio activation en milieu hypoxique donne des métabolites extrêmement réactifs qui créent des dommages considérables au niveau de l’ADN des cellules tumorales hypoxiques. En association aux traitements habituels ces bioreductives (pro) drugs que sont : Les nitro-imidazoles, les complexes de métaux, les quinones et le N-oxydes pourraient assurer ines destructions uniforme de la masse tumorale, réduisant ainsi les rechutes des cancers solides les plus réfractaires, leur métastisation et la toxicité systémique des traitements. De nombreuses études cliniques prometteuses s’attèlent à évaluer la valeur ajoutée que ces molécules (Tirapazamine, AQ4N, PR-104, TH-304) pourraient apporter à la pratique thérapeutique déjà existante

Cell Hypoxia

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Through this work, we have been able to bring to light three main classes of techniques to measure tumor hypoxia. Historically the polarography electrodes had remained the «Gold Standard» in terms of measure of hypoxic tumor. Then, non-invasive methods regarding oncologic treatments emerged. This paper will first introduce hypoxia and its impact on the different oncology’s treatments. We will then present in details the techniques used to measure the tumor hypoxia. This paper pretends mainly to describe the current and prospective methods we will eventually use in the future in the human clinic field. We therefore do not pretend to present an exhaustive list. We rather intend to offer an analyses on a bundle of specific techniques whose non-invasive characteristics are perfectly in accordance with the modem vision of medicine The pharmaco-economic aspects will not be developed for evident reasons of clarity and to offer a better focus on the subject of our thesis Au travers de ce travail, trois grandes classes de techniques de mesure de l’hypoxie tumorale se sont dégagées Les électrodes polarographiques qui restent le «gold standard » dans la mesure hypoxique tumorale, et puis l’émergence de méthodes non-invasives basées sur les phénomènes optiques ou nucléaires. Une brève introduction sur l’hypoxie et ses conséquences sur les traitements en oncologie sera présentée puis ces techniques de mesure de l’hypoxie seront décrites et discutées tout au long de l’exposé. Ce mémoire se veut avant tout une description des méthodes actuelles et envisageables dans un futur proche pour la clinique humaine Ce n’est donc volontairement pas une liste exhaustive mais plutôt une synthèse de plusieurs techniques d’imagerie, principalement axées sur leur non-invasivité, en harmonie avec la philosophie d’une médecine moderne. Les aspects pharmaco- économiques n’ont pas été abordes par souci de clarté et du positionnement du sujet de la thèse traitée

Polarography --- Cell Hypoxia

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Par analogie avec la notion de « pré-conditionnement ischémique » dans le domaine cardio-vasculaire, l'hypoxie intermittente (caractérisée par des cycles d'hypoxie - réoxygénation) observée dans de nombreuses tumeurs pourrait constituer une source de résistance aux traitements anti-tumoraux, en particulier pour les cellules endothéliales directement touchées par une interruption temporaire du flux sanguin (conséquence du remodelage permanent du réseau vasculaire tumoral).Dans ce mémoire, nous avons validé et exploité un protocole de « pré­ conditionnement hypoxique tumoral » pour documenter, à travers des tests de clonogénicité et de mesure de l'apoptose, la radio-résistance accrue de cellules endothéliales mises dans une situation mimant les cycles tumoraux d'hypoxie - réoxygénation ; une vérification in vivo de cette observation a également été apportée suite à l'application de la méthode 'TUNEL' à des coupes de tumeurs. Des mesures de phosphorylation de l'histone H2Ax ont, par ailleurs, révélé que la vitesse de réparation des cassures « double brin » dans I'ADN était plus grande en cas de pré-exposition à des cycles d'hypoxie - réoxygénation . Des expén'ences utilisant des siRNA dirigés contre HIF-1a ont également révélé l'implication paradoxale de ce facteur transcriptionnel dans les modifications phénotypiques associées à la résistance à des stress pro-apoptotiques comme la privation de sérum et la radiothérapie.En résumé, les résultats présentés dans ce mémoire accréditent l'hypothèse selon laquelle l'hypoxie intermittente caractéristique de nombreuses tumeurs puisse être une source intrinsèque de radio-résistance et ouvrent des perspectives de développement de traitements adjuvants aux stratégies anti-tumorales conventionnelles.Une partie de ce travail est inclue dans une publication du laboratoire soumise pour publication dans Cancer Research : Impact of hypoxia preconditioning on tumor vascular endothelial cell response to radiotherapy : discrepancies between cyclic and chronic hypoxia.

Endothelial Cells --- Cell Hypoxia --- Neoplasms

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Hypoxia plays a important role in tumor cell transformation into a malignant and more resistant phenotype. The efficacy of radiotherapy is indeed dependent on the level of oxygenation in the tumor. Therefore, several methods have been developed to measure tumor oxygen pressure. However, none of them is non-invasive, quantitative, and suitable for dynamic measurement in clinical setting. An emerging non-invasive MRI method is base on the water proton relaxation (“oxygen-enhanced MRI”) but suffers from lack in sensitivity. The aim of this research is to investigate a new non-invasive MRI measurement method named MOBILE “Mapping of Oxygen By Imaging Lipids relaxation Enhancement”. This technique detects oxygen variation by following the endogen lipids relaxation modification. As for oxygen-enhanced MRI, the method relies on oxygen’s paramagnetic properties since oxygen decreases T1 (longitudinal relaxation time) of protons (water protons for oxygen-enhanced MRI vs lipid protons for MOBILE). In order to validate MOBILE, 2 models of murine mammary tumors were used. We measured the variation caused by an hyperoxic breathing challenge (carbogen: 95%O2, 5%CO2) using the MOBILE sequence (lipids TA). MOBIEL was simultaneously compared to: (i) oxygen-enhanced MRI (T1H2O), (ii) T2* imaging (or functional imaging, based on the blood deoxyhemoglobin/oxyhemoglobin ratio), and (iii) a simultaneous and direct measurement by fluorescence quenching using fiber optic probes (OxyLite™). In a second time, we compared MOBILE with 2 quantitative oximetric techniques, respectively, 19F relaxometry (MRI cartography method requiring fluorine probes injection) and EPR (electronic paramagnetic resonance) spectroscopy (implying paramagnetic probe injection and giving localized measurements). The goal of this part was to investigate the quantitative aspects of MOBILE. In conclusion, our results demonstrate the higher sensitivity of MOBILE compared to the water protons techniques. Furthermore, the lipids T1 seems to correlate with the pO2 measured by EPR while the water T1 presents almost no relation L’hypoxie joue un rôle prépondérant dans l’évolution des cellules tumorales en une forme plus maligne et résistante à la radiothérapie. En effet, l’oxygène a la capacité de fixer et de propager les dommages causés par les radiations. Ainsi, plusieurs méthodes ont été développées afin de mesurer la pO2 tumorale mais, à ce jour, aucune n’est non-invasive, quantitative, et applicable de façon répétitive en clinique. Le but de ce travail est de valider une nouvelle méthode de mesure IRM des variations d’oxygénation, dont l’acronyme est MOBILE pour « Mapping of Oxygen By Imaging Lipids relaxation Enhancement ». Cette technique est sensible aux variations d’oxygénation via le suivi de la modification de relaxation des lipides endogènes. Jusqu’alors, une méthode non-invasive existant en IRM était basée sur la relaxation des protons de l’eau. En effet, dû à ses propriétés paramagnétiques, l’oxygène diminue le T1 (temps de relaxation longitudinal) des protons de l’eau. La sensibilité du T1 à l’oxygène a été utilisée pour mesurer des variations d’oxygénation tissulaire, mais cette méthode présente une très faible sensibilité. Le but de ce travail est d’améliorer la sensibilité de la méthode T1, en se basant sur la mesure des variations du T1 des protons des lipides, l’oxygène étant plus soluble dans les lipides que dans l’eau. Pour valider notre méthode, nous avons utilisé 2 types de modèles de tumeurs mammaires murines sur lesquelles nous avons mesuré et comparé les variations causées par l’inspiration transitoire de carbogène (95%O2, 5%CO2) via la séquence MOBILE (T1 des lipides), en comparaison avec le T1 de l’eau, le T2$ (ou imagerie fonctionnelle, basée sur les variations du rapport déoxyhémoglobine/oxyhémoglobine du sang), et une mesure simultanée et directe de l’oxygénation par quenching de fluorescence via une sonde invasive (OxyLite ™). Dans un deuxième temps, nous avons comparé MOBILE à 2 méthodes de mesures quantitatives, respectivement, l’oxymétrie par relaxométrie du 19F (méthode de cartographie en IRM nécessitant l’injection de sondes fluorées) et l’oxymétrie RPE ou résonance paramagnétique électronique, (méthode nécessitant l’injection d’une sonde paramagnétique et fournissant une mesure localisée). Cette partie du travail a pour but d’investiguer le caractère quantitatif de MOBILE. En conclusion, nos résultats attestent que la sensibilité de MOBILE est supérieur au T1 de l’eau et que le T1 des lipides semble varier proportionnellement aux pO2 mesurées en RPE alors qu’en eau, la relation est pratiquement nulle

Cell Hypoxia --- Magnetic Resonance Imaging

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In the attempt to limit tumor growth and cancer cell spreading in the organism, and so the formation of metastasis, one of the actual targets in cancer research is stopping angiogenesis. Moreover, selectivity for hypoxia could target solid tumors whilst avoiding side effects on healthy tissues that are normoxic. At the UCL Pharmacognosy group research, a bioguided fractionation has been performed on Cissampelos owariensis, a Beninese plant, in order to identify anti-angiogenesic compounds with selectivity for hypoxia. We identified pheophorbide a, a chlorophyll derivative, as the main compound in the most interesting extract, and also showed that this molecule had no selectivity ty for hypoxia but actually for light, pheophorbide a being photosensitizer. In collaboration with the University of Abomey-Calavi (UAC) in Benin, we also quantified pheo phorbide a concentration in different samples, and demonstrated that environmental factors such as growth place of C. owariensis, climate or ground composition, influence the concentration of pheophorbide a in the plant, rather than the type ("wild" or "cultivated"). Finally, ta prove the importance of the conservation method of vegetal samples after plant harvesting, we demonstrated that dipping fresh plants in boiling water can avoid the formation of chlorophyll derivatives during drying and extraction, which allows the measurement of the initial pheophorbide a content in the plant. Afin de limiter la croissance tumorale ainsi que la propagation de cellules cancéreuses dans l'organisme et donc la formation de métastases, une des cibles actuelles dans la recherche contre le cancer est de bloquer l'angiogenèse. De plus, la sélectivité pour l'hypoxie permettrait de cibler les tumeurs solides en évitant des effets secondaires sur les tissus sains qui sont normoxiques. Au laboratoire de pharmacognosie de l'UCL, un fractionnement bioguidé a été effectué sur Cissampelos owariensis, une plante originaire du Bénin, afin d'identifier des composés anti-angiogéniques posséda nt une activité sélective pour l'hypoxie. Ce fractionnement a permis d'identifier le phéophorbide a, un produit de dégradation chlorophyllien, comme étant le composé majoritaire de l'extrait le plus intéressant. Cependant, la sélectivité à l'hypoxie premièrement mise en évidence s'est avérée être une sélectivité à la lumière, le phéophorbide a étant un composé photoactivable et les tests effectués en hypoxie étant effectués à la lumière tandis que ceux en normoxie étaient réalisés à l'obscurité. Nous avons également, en collaboration avec l'Université d'Abomey-Calavi (UAC) au Bénin, dosé le phéophorbide a dans différents échantillons, ce qui a permis de montrer que des facteurs environnementaux tels que le lieu de culture de Cissampelos owariensis, le climat ou la composition du sol, auraient une plus grande influence sur la concentration en phéophorbide a dans la plante, plutôt que le caractère « sauvage » ou « cultivé » de celle-ci. Finalement, afin de montrer l'importance de la méthode de conservation des échantillons végétaux après récolte, il a été démontré qu'un pré-traitement par ébouillantage empêche la formation de dérivés chlorophylliens lors du séchage et de l'extraction, permettant ainsi de doser la teneur initiale en phéophorbide a dans la plante.

Cissampelos --- Angiogenesis Modulating Agents --- Cell Hypoxia --- Neoplasms